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基因組DNA提取常見問題分析 solarbio

更新時間:2010-10-24  |  點擊率:7399

 

基因組DNA提取常見問題分析
 

常見問題
可能原因
建議解決方案
洗脫產物的DNA量很少或沒有
所提樣品材料老化或反復凍融導致基因組DNA含量下降
應選擇新鮮的樣品材料,如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組織或幼嫩的植物組織等,不能即時處理的樣品應立即放入液氮或-70℃低溫保存,以免DNA降解。
樣品破壁或裂解不*導致基因組DNA未充分釋放
動、植物材料應在液氮中充分研磨勻漿,G+細菌、酵母等破壁較困難的樣品應用溶菌酶、酵母破壁酶或機械方式協助破壁,不同樣品的細胞破壁方式可參照前面的詳細介紹。
樣品量過多導致細胞裂解不充分
加樣量過多使裂解液和樣品混合不均勻,細胞裂解不充分。不同來源樣品的加樣量請參照詳細操作步驟。
DNA吸附不充分
如在上吸附柱前末加無水乙醇,或用低濃度乙醇代替無水乙醇,則導致DNA不能充分沉淀,與硅膠膜吸附不*,因此應在樣品裂解后加適量無水乙醇,再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。
DNA洗脫不適當
洗脫液pH值過低會降低洗脫效率,應確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間;洗脫體積若小于30μ,則不易*浸透硅膠膜,使DNA不能全部洗脫下來,因此洗脫液體積應大于30 μl,同時如洗脫液體積過大,超過200μl,則所得的DNA濃度會降低,但DNA總量不會減少;洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70水浴預熱,加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘,可提高洗脫效率,提高基因組DNA的產量。
提取的基因組DNA有降解
選取的材料不新鮮或反復凍融,采集材料后未及時處理或末低溫保存
陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中,細胞凋亡導致DNA降解,或低溫保存的樣品反復凍融導致細胞破碎,內源核酸酶降解DNA,因此應選擇新鮮的材料樣品,不能及時處理則低溫保存,運輸過程中亦應使用干冰。
未能有效抑制內源核酸酶作用
某些DNase含量較豐富的動、植物組織樣品應在液氮中研磨或勻漿,研磨過程中應隨時補充液氮,并在樣品末*解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。
操作過于劇烈導致DNA被機打斷
預處理的樣品加入細胞裂解液后,所有操作應盡量柔和,避免振蕩、攪拌等劇烈機械力對DNA片段的損傷。
提取的基因組DNA中有RNA污染
實驗過程中沒有有效使用RNase A
應嚴格按照實驗操作要求使用,即加入裂解液的同時加入20μl RNase A溶液,室溫放置10分鐘。
RNAase A可能失活
RNase A須在-20℃下保存,低溫保存時RNase A比較穩定,不易失活,但如果反復凍融會導致RNase A降解失活,所以應妥善保存。
提取的基因組DNA不能順利地進行后續試驗
樣品量過多導致細胞裂解不充分
樣品量過多會使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合,從而導致樣品裂解不*,殘留大量蛋自、多糖、脂類等雜質,為后續的上吸附柱分離純化造成影響。應加入適當量的樣品材料,具體數量請參照詳細操作步驟。
DNA在洗脫前有大量乙醇殘留
有機溶劑乙醇可嚴重抑制內切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA過柱洗滌過程中需使用含有乙醇的漂洗液,因此在洗脫DNA前,—定要充分去除殘留的乙醇,可重復離心,或將吸附柱置于室溫或50℃溫箱中烘干5-10分鐘,再加洗脫液。




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